Введение
Красные водоросли содержат в значительных количествах сульфатированные полисахариды - каррагинаны, которые выполняют ряд важнейших функций в макрофитах. Эти полисахариды обладают уникальными физико-химическими 'свойствами, благодаря чему широко используются в различных областях пищевой промышленности, и относятся к так называемым «пищевым» или «диетическим» волокнам. Не менее важными являются биологические свойства каррагинанов, среди которых наибольший интерес представляют антиязвенная, антикоагулирующая, иммуностимулирующая, противоопухолевая и противовирусная активности.
Физико-химические и биологические свойства этих полисахаридов находятся в тесной взаимосвязи с их структурой, которая характеризуется большим разнообразием и "замаскированной регулярностью", Каррагинаны построены из повторяющихся дисахаридных звеньев D-галактозы и ее производных, соединенных регулярно чередующимися Р-(1—>4) и а-(1—>3) гликозидными связями. В настоящее время установлены структуры около 20, так называемых, «идеализированных» типов каррагинанов, различающихся содержанием 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп. Природные каррагинаны редко соответствуют таким регулярным структурам, состоящим из одинаковых дисахаридных звеньев, чаще всего они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов, что объясняется многоступенчатым биосинтезом полисахаридов в клеточной стенке водоросли.
Структура каррагинанов зависит от множества факторов, которые условно можно разделить на экзогенные, определяемые условиями произрастания водоросли, а именно освещенностью, температурой и соленостью воды, и эндогенные, связанные с физиологией водоросли, в частности их видовой принадлежностью и стадиями развития. Последний фактор особенно важен, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий чередование вегетативного, полового и бесполого размножения. Первые
работы по структуре каррагинанов проводились в основном на образцах полисахаридов, выделенных из смеси водоросли разных генераций -гаметофитов и спорофитов. Такой подход часто приводил к получению противоречивых результатов. В последние годы структурные исследования каррагинанов, проводят учитывая фазы жизненного цикла водоросли, из которой они выделены. Это позволяет, во-первых, более точно установить структуру новых типов каррагинанов, а во-вторых, оценить влияние этого фактора на биосинтез полисахаридов. Взаимосвязь между условиями обитания водорослей и их физиологией, а также биохимическим составом изучалась несколькими группами иностранных исследователей. Были получены данные, свидетельствующие как о наличии корреляции между скоростью роста водорослей и биосинтезом ими каррагинанов, так и ее отсутствии. При этом, данные о влиянии таких важных параметров, как температура воды и фотосинтетически активная радиация (ФАР) на структуру и свойства синтезируемых полисахаридов немногочисленны. Вместе с тем, эти исследования могут служить хорошей основой для развития морской биотехнологии. В нашей стране, обладающей промысловыми запасами водорослей, подобные работы отсутствуют, хотя глубоким и систематическим изучением структуры полисахаридов водорослей занимается группа под руководством профессора А.И. Усова в Москве. Однако отдаленность источника предмета исследования от исполнителей не всегда позволяет учитывать те особенности, которые во многом определяют структуру и свойства выделяемых полисахаридов.
В морях Дальнего Востока обширные промысловые запасы водорослей образованы представителями семейств Gigartinaceae (Chondrus armatus и Chondrus pinnulatus) и Tichocarpaceae (Tichocarpus crinitus). Водоросль Tichocarpus crinitus, являясь эндемиком тихоокеанского побережья, представляет особый интерес, так как благодаря своему быстрому росту, крупным размерам и особенностям развития может рассматриваться как перспективный вид для производства полисахаридов Ранее было показано, что и Т. crinitus и С. pinnulatus относятся к каррагинанофитам. Однако, одно
только таксономическое положение водоросли не дает полной информации о структуре синтезируемого полисахарида каррагинана. Оценка влияния различных факторов на структуру и свойства каррагинанов из промысловых видов водорослей имеет как фундаментальный, так и прикладной интерес. Эти исследования с одной стороны могут дополнить и уточнить общую концепцию биосинтеза полисахаридов в процессе .онтогенеза водорослей, а с другой стороны могут быть полезными при решении вопросов рационального использования водорослей, в частности их плантационного культивирования и промышленного производства каррагинанов.
6 2. Литературный обзор.
Морские водоросли используются в пищевых целях и медицинской практике более шести веков, но только в середине двадцатого столетия начинается активный поиск и выделение из них биологически-активных .веществ. Как и в случае наземных растений, преобладающим компонентом биомассы водорослей являются углеводы. Эти в"ещества служат энергетическим резервом и играют роль опорных структур, участвуя в построении клеточных стенок и образуя межклеточное вещество.
Красные водоросли содержат уникальные сульфатированные полисахариды - галактаны - агар и каррагинан, которые нигде в природе более не найдены [1]. Галактаны выполняют следующие функции в водорослях:
а) ассоциируют с клеточной стенкой и образуют межклеточное вещество, назначение которого - цементировать клетки и обеспечивать целостность и механическую прочность всего растения.
б) обладают ионнообменными свойствами, и таким образом защищают клетку от проникновения нежелательных катионов, или напротив, концентрируют необходимые.
в) удерживают большое количество воды, защищая клетки от высыхания (особенно при отливах).
Впервые название "каррагин" появилось в 1837 г. для обозначения широко используемых в пище морских водорослей Irish moss, произрастающих в большом количестве на южном побережье Ирландии в небольшом местечке Каррагин [2]. Чуть позже эти водоросли обнаружены на побережье Соединенных Штатов, где они становятся предметом торговли [3]. Стэнфорд называет каррагином желирующее вещество, выделенное водной экстракцией из водорослей Chondrus crispus, больше известных как "ирландский мох" [2]. В 1871 г. был запатентован процесс его экстракции и очистки [4]. И только в 30-х гг. XX столетия начинается индустриальное производство этого продукта, его назвали - каррагинан, появившийся суффикс "-ан" отражает его принадлежность к полисахаридам [5].
В настоящее время наблюдается постоянный рост производства каррагинана. В начале 1990-х г.г. годовое производство полисахарида достигло 15.5 тыс. т. в год. Ежегодно оно увеличивается на 5% и в ближайшее время может составить свыше 30 тыс.т. [6]. Основные компании, производящие каррагинан, сосредоточены в Европе и США. В последнее время очень активно развивается производство каррагинана на Филиппинах, в Чили и в Китае. Ежегодные продажи каррагинана в мире исчисляются суммой более-чем 200 млн. долларов США. Увеличение объема производства каррагинана обусловлено повышенным спросом на продукты питания, в состав которых он входит. На рис. 1 показано распределение потребления каррагинана по регионам мира.
Япония 8%
Европа 36%
Австралия 13%
Латинская
Америка
17%
Северная Америка 26% Рис.1. Уровень потребления каррагинана по регионам мира [6].
Такой широкий интерес к каррагинану обусловлен его физико-химическими свойствами. Полисахарид обладает способностью увеличивать вязкость водных растворов и образовывать крепкие гели при определенных условиях, что обеспечивает его использование в пищевой и легкой промышленности, фармацевтике и биотехнологии. Разносторонняя биологическая активность каррагинана в сочетании с физико-химическими свойствами позволяет его использовать и в медицине.
8
2.1. Источники каррагинана.
В мировом океане насчитывается около 4000 видов красных водорослей, из которых более 250 имеют промышленное использование. Каррагинанофиты обнаружены среди многочисленных видов различных семейств красных водорослей: Gigartinaceae, Solieriaceae, Hypne~aceae, Phyllophoraceae, Petrocelidaceae, Caulacanthaceae, Cystocloniaceae, Rhabdoniaceae,
Rhodophyllidaceae [7], Furcellariaceae [4], Tichocarpaceae [8] и Dicranemataceae
[9].
Основные виды водоросли, которые используются для производства каррагинана, включают: Chondrm crispus, С. ocellatus, Gigartina aciculari, G. pistillata, G. stellata (Mastacarpus stellatus), G. canaliculata (G. canaliculatus), G. radula, G. skottsbergii, Eucheuma cottonii {Kappaphycus alvarezii), E. spinosum (E. denticulatum), E. gelatinae, Furcellaria fastigata и Нурпеа musciformis [6, 4]. Большие запасы С. crispus находятся у берегов Канады, а вместе с G. stellata они образуют обширные залежи на побережье Франции и Испании [4, 10]. Вдоль южного побережья Франции, севера Португалии и Марокко распространены G. acicularis и G. pistillata [4]. Основные промысловые запасы красных водорослей в Чили представляют Sarcothalia crispata, G. skottsbergii и Mazzaella laminarioides [И]. В Индонезии и на Филиппинах добывают Е. cottonii и Е. spinosum [4], В Австралии и Новой Зеландии преобладают некоторые виды Gigartina и завезенной с Филиппин и культивируемой Euchena sp. [12].
Большой вклад в поиск источников каррагинана среди водорослей Японского моря Российского побережья внес профессор А.И. Усов, который изучил состав и строение полисахаридов нескольких десятков водорослей. Итогом проведенного в середине 80-х гг. исследования явилось обнаружение среди красных водорослей Японского моря восьми источников каррагинанов, шесть из которых - Chondrus pinnulatus, С. armatus, С. yendoi, Gigartina ochotensis, G. unalaskensis, Rhodoglossum hemisphaericum - представители сем. Gigartinaceae.
цистокарпы
Рис.2. Каррагинанофиты :
l-Chondrits armatus 2-Tichocarpus crinitus
10
один - Tichocarpus crinitus, из сем. Tichocarpaceae и один Turnella mertensiana, из сем. Solieriaceae [I, 13].
Позднее в поисках новых источников каррагинанов были исследованы водоросли западного побережья залива Петра Великого Японского моря. Высокое содержание каррагинана обнаружено в представителях семейств Phyllophoraceae (виды рода Gymngongrus) и Gigartinaceae {Mastocarpus pacificus и Iredaea dbrnucopiae), а также в трех видах рода Chondrus. Представители последнего широко распространены во всех морях Дальнего Востока, но чистых зарослей не образуют, а смешаны с другими красными водорослями [14].
2.2. Химическая структура каррагинана.
Хотя промышленный выпуск каррагинана начался в 1937 году, данные об его структуре появились значительно позже. Было показано, что каррагинаны
представляют собой сульфатированные галактаны, состоящие из
"Г QV-trJi повторяющихся дисахаридных звеньев'¦' D-галактозы и ее производных,
соединенных регулярно чередующимися р-(1—»4) и а-(1—»3) гликозидными связями [15]. Благодаря многочисленным работам Риса с соавторами было установлено несколько "предельных" или идеализированных структур каррагинана, что позволило разделить каррагинаны на "типы", различающихся содержанием 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп [16-19]. Различное количество и местоположение сульфатных групп, а так же присутствие или отсутствие 3,6-ангидро-0-галактозы позволяет предположить существование 45 дисахаридных звеньев. К настоящему времени известно около 20 из них [20]. Регулярные полисахариды, молекулы которых построены из повторяющихся дисахаридных звеньев одного типа, получили собственные названия. На схеме 1 представлены дисахаридные звенья основных типов каррагинана. В соответствии со структурными особенностями повторяющегося звена особо выделяют 6, так называемых, идеализированных, структур каррагинана, которые представлены строго чередующимися звеньями
II
но сн2он
CH2OSO3
Л
он он
у-каррагинан
"o3so сн.он
ch2oso;
он
он
jn-каррагинан "o3so сн.он ch2oso]
он oso^
v-каррагинан
сшон
ch2oso7 Л___о
oso;
oso;
Х-каррагинан но сн.он сн2он
o3so
oso3
?-каррагинан
но сн2он
он он
Р-каррагинан
"°3SOCH2OH
он он
к-каррагинан
"o3so сн2он
он oso3
i-каррагинан
но сн2он 1 -2 - - о-
OS О,
OSOo
Э-каррагинан
он он
оо-каррап^нан
Схема 1. Дисахаридные звенья основных типов каррагинана.
12
дисахаридной цепи - X, v, [i, к, 0, t. Некоторые каррагинаны, кроме сульфатных групп, могут содержать и другие заместители. Небольшое количество б-О-метил-О-галактозы было обнаружено в к-каррагинане из Kappaphycus alvarezii [21]. Во многих каррагинанах присутствует ксилоза, но ее местоположение часто остается неопределенным. В случае необычного полисахарида из Phacelocarpus peperocarpos по результатам анализа ЯМР-спектроскопии было установлено положение ксилозного остатка-при С-3 4-a-D-галактозы, а в i-каррагинане из Eucheuma denticulatim этот моносахарид находился при С-6 З-Р-О-галактозы [22, 23]. Каррагинаны с высоким содержанием пирровиноградной кислоты были выделены из водорослей рода Callophycus (Solieraceae) [24]. Пирровиноградная кислота образует циклические ацетали при С-4 и С-6 галактозного остатка, которые часто встречаются в дисахаридных звеньях а- и 9-каррагинанов [25, 26, 27]. Во многих видах водорослей семейств Cryptonemiales, Rhodymeniales и Bonnemaisoniales были обнаружены сульфатированные галактаны, имеющие D/L-гибридную структуру, то есть содержащие агар [29-30], В водорослях семейства Gigartinales, известных как классические источники каррагинана, содержатся в небольшом количестве подобные гибриды [31].
Природные полисахариды редко соответствуют структурам, состоящим из одного повторяющегося дисахаридного звена, обычно наблюдается комбинация двух или более в одной полимерной молекуле [32, 33]. Так, например, полисахариды, выделенные из промысловых водорослей Sarcothalia crispata, Mazaella laminarioides и Chondrus crispus, имеют гибридную структуру к/i-каррагинанов [34]. Высоко сульфатированный полисахарид со сложной структурой из красной водоросли Melanema dumosum, растущей у берегов Австралии, был идентифицирован как гибрид i/к/р-каррагинанов [35]. Исследование полисахаридов из пяти видов водорослей Dicranemataceae показало, что все они имеют гибридную структуру р/к-каррагинана [9].
13
Структура выделяемых полисахаридов зависит от условия проведения экстракции. Так, при проведение'предварительной обработки водоросли ]/ щелочью из ^.-каррагинана формируется 0, но этот процесс происходит редко, более часто из к- и i-каррагинанов образуются ц- и v- , соответственно [36]. На соотношение различных типов каррагинана в экстракте влияет и температура, при которой происходит процесс выделения. Например, в экстракте, полученном при комнатной температуре из G. skottsbergii с гаметофитами, соотношение к- и i-каррагинанов составляет 1:0.30, в то время как при повышении температуры увеличивается содержание i-каррагинанов (1:0,43) и дополнительно экстрагируется значительное количество предшественников [37]. Полисахариды, полученные экстракцией при разных температурных режимах из Agardhiella subulata, не отличались по структуре. Небольшое различие заключалось в присутствии предшественников в экстракте, полученном при температуре 24°С [38].
Предполагается, что наличие гибридной структуры объясняется ступенчатым биосинтезом галактанов, в процессе которого вначале из остатков галактозы строится регулярная основа полимерной молекулы, затем происходит сульфатирование и, наконец, ферментативное элиминирование сульфатов из положения 6 4-0 замещенных остатков галактозы. Ферментативное элиминирование приводит к образованию ангидроциклов. Поскольку реакции модификации полимерных молекул могут протекать не полностью, то конечным продуктом биосинтеза может быть "молекулярный гибрид", содержащий одновременно звенья нескольких типов каррагинанов [13]. Поэтому в настоящее время все известные каррагинаны сгруппированы в четыре основных семейства: к, р, X, со, что отражает путь биосинтеза данных полисахаридов. Для Р-семейства характерно полное отсутствие сульфатных групп, в к-, А,- и со-типах сульфатные группы локализованы при С-4, С-2 и С-6, соответственно [39, 40, 41]. Внутри каждой группы существуют полисахариды с более сложной гибридной структурой. Eucheuma gelatinnae, являющаяся источником р-каррагинана, содержит молекулы с гибридной структурой, относящейся к р- и к-типам, и небольшое количество олигосахаридов, полученных при расщеплении к-каррагиназой [42]. Галактаны, выделенные из Furcellaria lumbricali (Huds.)
14
Lamour. могут быть отнесены, по крайне мере, к трем выделенным семействам: (3, к и со [43].
В тоже время термин "каррагинан" довольно старый и является общим названием для структур, содержащих чередующиеся З-Р-О-галактопиранозное и 4-а-0-пиранозное звенья. В связи с этим, Кнутсен с соавторами предложил новую номенклатуру: для полисахарида, в основе которого лежат эти чередующиеся фрагменты, сохраняется прежнее название - каррагинан, а для структуры, в которой присутствует 3,6-ангидрогалактоза предложен новый термин - каррагиноза. Кроме этого, вводится буквенный код, где 4-О-галактоза обозначается через D, а З-О-галактоза - G, а различным заместителям присваивается свой код (табл.1) [44].
Таблица. 1. Обозначения по новой номенклатуре и ШРАС.
Буквенный код Полное название (ШРАС)
D 4-а-О-галактопиранозил
DA 4-3,6-ангидро-О-галактопиранозил
G З-р-О-галактопиранозил
S . сульфатные группы
М О-метил
Р 4,6-О-(1-карбоксиэтилиден)
Вводимую номенклатуру предлагается использовать для обозначения гибридных структур или их соответствующих фрагментов, а так же при интерпретации ЯМР спектров.
15 2.3. Факторы, влияющие на биосинтез каррагинана.
Биосинтез каррагинана в клеточной стенке водоросли зависит от множества факторов, которые можно разделить на экзогенные, определяющиеся условиями произрастания водоросли - температура, соленость, освещение и сезонность; и на эндогенные, связанные с видовой принадлежностью водоросли и ее физиологией, в частности, со стадией ее жизненного цикла" и возраста водоросли. [15, 32, 46, 47]. Последнее особенно важно, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий в себя чередование вегетативного, полового и бесполого размножения. Наиболее простым является вегетативное размножение, когда водоросль размножается фрагментами слоевища или путем образования дополнительных побегов. Бесполое размножение осуществляется с помощью специальных спор - моноспорами у простейших и тетраспорами у высших. При половом размножении происходит оплодотворение, в результате которого образуются карпоспоры у простейших или цистокарпы у высокоорганизованных растений. Цистокарпы это достаточно крупные видимые невооруженным глазом плотные выпуклые образования на поверхности или внутри слоевища. Многие ученые признают цистокарпы третьей фазой в цикле развития водорослей -карпоспорофитами, которые ведут паразитический образ жизни на женском гаметофите. Растения, образующие споры, называют спорофитами, а образующие гаметы - гаметофитами. Спорофиты и гаметофиты могут резко различаться по внешнему виду (нередки случаи, когда их ошибочно относили к разным родам), но могут быть и очень сходными (изоморфными) [48].
Первые структурные работы по каррагинану были выполнены на смеси различных типов полисахарида, выделенных из неразделенных в соответствии с фазой развития водорослей. Этот факт существенно затруднял интерпретацию полученных данных и не позволял корректно установить структуру исследованных полисахаридов. Позже появились структурные исследования каррагинанов, выделенных из водорослей, строго соответствующих определенной стадии жизни. Было установлено, что водный экстракт из водоросли Chondrus crispus с карпоспорофитами содержит, по крайне мере, три различных типа каррагинана,
16
тогда как полисахариды, выделенные из тетраспорофитов, представляли собой практически чистый Х-каррагинан [49].
енскийя гаметофит
мужской гаметофит
выход тетраспор
оплодотворение
тетраспорофиты
карпоспорофиты
выход карпоспор
Рис. 3. Цикл развития красной водоросли С. pinnulatus.
В дальнейшем разделение водорослей по стадиям жизненного цикла позволило, во-первых, установить структуру новых типов полисахарида, а во-вторых, изучить влияние этого фактора на биосинтез каррагинана.
К настоящему времени установлено, что водоросли на разных жизненных стадиях продуцируют разные типы каррагинана. Глубокое исследование полисахаридного состава водоросли в зависимости от фазы ее жизненного цикла проведено на водорослях семейства Gigartinaceae. Водоросли Iridaea ciliata и /. membranaceae с цистокарпами продуцируют к-каррагинан, тогда как из тетраспорофитов можно выделить KCl-растворимый полисахарид, но не имеющим ч \j
17
структуру классического А.-каррагинана [50]. Более тщательное исследование каррагинанов, выделенных из /. undolose и Gigartina skottsbergii показало, что водоросли с цистокарпами продуцируют две фракции полисахарида: первая фракция — KCl-растворимый, частично циклизированный p/v-каррагинан, другая — гелеобразующий к/т. Вместе с тем, тетраспорофиты из этой водоросли содержат X-каррагинан, образующий гель при высокой концентрации КС1 [51, 52]. Позже было показано, что G. skottsbergii с цистокарпами продуцирует кроме основных к/т- и p/v-каррагинанов небольшое количество полимера, состоящего из 41% к-, 18% 1-, 29% X-звеньев и 4,5% галактозы [53]. В большинстве случаев тетраспорофиты продуцируют не чистый А.-каррагинан, а смесь галактанов с низким содержанием 3,6-ангидро-О-галактозы. Полисахариды, выделенные из тетраспорофитов Gigartina clavufera и G. alveata имеют структуру в основном Ъ,- и тг-каррагинанов [26]. Позже было обнаружено, что небольшое количество 9-каррагинана также может быть выделено из водорослей рода Gigartina с тетраспорами [41]. Полисахарид со структурой, близкой к идеализированной структуре А,-каррагинана, был выделен из эндемической водоросли Gigartina decipiens (Новая Зеландия) и G. anceata [54, 55]. Большинство представителей Phyllophoraceae со спорофитами содержат Я.-каррагинан, в то время как гаметофиты - к-тип каррагинана [56]. Вместе с тем, показано, что представители Soleriaceae, Hyoneaceae и Furcellariaceae синтезируют только к- и 0 - каррагинан независимо от генерации [57, 58]. Это подтверждает, что таксономическое положение водоросли не дает полной информации об ее полисахаридном составе и доказывает, что фаза развития водоросли является важным фактором, влияющим на биосинтез каррагинана.
В последнее десятилетие особое внимание уделяется условиям произрастания водоросли и влиянию таких параметров как температура вода,4 освещение и время сбора. Результаты экспериментальных работ Троно с соавторами свидетельствуют о количественных и качественных изменениях каррагинанов, связанных с ростовыми процессами макрофитов [59]. В тоже время литературные данные по этому \/ взаимодействию противоречивы. Так71Глетний период наблюдается положительная корреляция между содержанием каррагинана и ростом водоросли Cystoclonium purpureum. Наибольшее количество каррагинана синтезируется летом (36%), тогда как осенью происходит снижение накопления полисахарида в 3 раза (13%) [60]. Было |
