3 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Диарейные заболевания относятся к числу наиболее распространённых среди людей и животных и создают одну из серьёзнейших проблем современной медицины и ветеринарии. Возбудителями диареи могут быть различные микроорганизмы, но чаще всего заболевание вызывается токсигенными энтеробактериями. Заражение происходит перорально. Факторами передачи бактерий являются инфицированные продукты и вода [Бондаренко, 1987; Guth, Pickett, 1986]. Наиболее восприимчивыми к токсикоинфекциям являются дети младшего возраста и молодняк сельскохозяйственных животных. Диарейные заболевания распространены и в клеточном звероводстве, являясь основной причиной повышенного отхода молодняка пушных зверей и ослабления иммунной системы организма.
Проблема острых кишечных инфекций до настоящего времени остаётся одной из важнейших в инфекционной патологии пушных зверей. Отмечается возрастающий удельный вес заболеваний, вызываемых бактериями сем. Enterobacteriaceae, относящихся к группе условно-патогенных микроорганизмов [Бондаренко, 2002; Зенин-Бермес, 1985; Канарейкина и др.,1981]. Детекция энтеробактерий, продуцирующих термолабильный и термостабильные энтеротоксины, ответственных за диарейный компонент при острых кишечных инфекциях, является одной из важнейших задач, направленных на повышение эффективности диагностики диарейных заболеваний.
Термолабильный (LT) и термостабильные (ST) энтеротоксины, синтез которых кодируется плазмидами [Dallas et al., 1980; So et al., 1980; Moseley et al., 1983], поражают органы пищеварения, выделения и активизируют других возбудителей диарей. Способность продуцировать энтеротоксины передаётся представителям других родов энтеробактерий. Поэтому важным этапом борьбы с энтеротоксигенными бактериями является разработка эффективных методов обнаружения как токсигенных микроорганизмов, так и продуцируемых ими токсинов.
Для обнаружения токсигенной микрофлоры используют два принципиальных подхода: либо поиск самого токсина, либо поиск генетических детерминант, ответственных за его продукцию бактериальной клеткой. Стандартный биологический метод, используемый для детекции энтеротоксигенных штаммов, позволяет определить биологически активный токсин. В последнее время широкое распространение получили молекулярно-генетические методы, позволяющие обнаружить генетические детерминанты, отвечающие за продукцию токсинообразования [Moseley et al.,1982; Кафтырева и др., 2004]. Такими методами являются ДНК-ДНК гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР).
4
Всё это делает актуальным как изучение распространения энтеротоксигенных штаммов в патологическом материале, кормосмесях для пушных зверей, объектах окружающей среды, так и разработку методов их обнаружения.
Цель исследования. Целью данного исследования является изучение распространения генов токсинообразования в популяциях энтеробактерий, изолированных из кормов и патологического материала, полученного от пушных зверей зверохозяйств, изучение частоты встречаемости различных типов энтеротоксинов и проведение сравнительного анализа эффективности методов индикации токсигенной микрофлоры.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Выделить из кормов пушных зверей и патологического материала бактерии, принадлежащие к сем. Enterobacteriaceae, и провести их идентифицикацию.
2. Провести тестирование энтеробактерий на способность к токсинообразованию с использованием биологического метода.
3. Сконструировать биотинилированные зонды на основе фрагментов генов токсинообразования LT, STa и STb для детекции потенциальных возбудителей токсикоинфекций, подобрать оптимальные условия гибридизации и провести скрининг штаммов лабораторной коллекции на наличие генов токсинообразования методом дот-блот гибридизации.
4. Подобрать нуклеотидные праймеры для детекции генов токсинообразования LT, STa и STb методом полимеразной цепной реакции, подобрать оптимальные условия проведения ПЦР и проанализировать коллекцию штаммов, изолированных из кормов и патологического материала, на наличие генов токсинообразования методом ПЦР,
5. Провести сравнительный анализ эффективности методов индикации токсигенной микрофлоры.
Научная новизна исследования состоит в том, что:
- впервые изучен с качественной и количественной сторон видовой состав энтеробактерий, изолированных из кормов пушных зверей, и определена частота встречаемости представителей сем. Enterobacteriaceae;
- впервые исследована репрезентативная коллекция штаммов, выделенных из кормов и патологического материала, на наличие энтеротоксинов;
- впервые установлены типы токсинов, встречаемые в кормах и патологическом материале, с привлечением самых современных молекулярно-генетических методов.
5 Практическая ценность работы.
Практическая ценность состоит в том, что определён видовой состав микрофлоры, обсеменяющей кормосмеси пушных зверей, разработаны методы ДНК-гибридизации на основе сконструированных нами генно-инженерным путём нерадиоактивных зондов для определения генов токсинообразования. При разработке ПЦР-метода для детекции энтеротоксигенных штаммов, нами подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты ДНК, соответствующие LT, STa, STb токсинам энтеробактерий.
Основные положения, выносимые на защиту
- изучение видового состава энтеробактерий, обсеменяющих кормосмеси пушных зверей,
- разработка молекулярно-генетических методов детекции энтеротоксигенных штаммов на основе ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции,
- скрининг коллекции энтеробактерий молекулярно-генетическими методами и проведение сравнительного анализа эффективности методов детекции токсигенной микрофлоры.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Систематика семейства Enterobacteriaceae
Микроорганизмы, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae, многочисленны и разнообразны по своим биологическим свойствам.
Для энтеробактерий характерными признаками являются палочковидная форма клеток, грамотрицательная окраска, расщепление глюкозы ферментацией; отсутствие цитохромоксидазы и способность восстанавливать нитраты до нитритов (за исключением некоторых видов Enterobacter и Erwinia).
Семейство Enterobacteriaceae объединяет обширную группу грамотрицательных палочек, подвижных или неподвижных перитрихов, образующих или не образующих капсулы. Энтеробактерий спор не образуют, являются аэробами или факультативными анаэробами, не кислотоустойчивы.
Энтеробактерий растут на простых питательных средах, но некоторые нуждаются в специальных ростовых добавках; питание осуществляют за счет органических соединений; механизм метаболизма дыхательный и ферментативный. Образуют кислоту при ферментации глюкозы, а также других углеводов и спиртов с образованием газа и без газообразования. Каталазоположительны, за исключением Shigella dysenteriae.
Степень родства определяется как по сходству содержания гуанина + цитозина, так и по последовательности нуклеотидных оснований. В дезоксирибонуклеиновой кислоте G+C у энтеробактерий равно 39—59 моль% [Покровский, 1985].
Семейство Enterobacteriaceae разделено на роды и виды. Роды объединены в группы на основе гомологии нуклеотидного состава ДНК.
Основными таксономическими категориями признаны род и затем вид. Согласно классификации Bergey Manual of systematic Bacteriology [1984], семейство Enterobacteriaceae состоит из 14 родов, которые имеют различное число видов. Род Escherichia включает 2 вида Е. coli и Е. blattae; род Shigella состоит из 4 видов; род Salmonella - имеет 5 подродов, объединяющих 11 видов; род Citrobacter - из 3 видов; род Klebsiella - из 4 видов, один из которых К. pneumoniae имеет 3 подвида; род Citrobacter включает 3 вида; род Enterobacter - 5 видов и 4 не относящихся к конкретному виду, но принадлежащих к роду Enterobacter ; род Erwinia объединяет 15 видов, один из которых имеет 2 подвида, а 4 вида не имеют определённой таксономической позиции. Род Serratia состоит из б видов; род Hafnia представляет один вид Н. alvei; род Edwardsiella - из 3 видов; род Proteus - из 3 видов; род Providencia - также из 3 видов; род Morganella представлен одним видом М. morganii.
В последней классификации семейства Enterobacteriaceae появилось ещё 6 родов, представленных одним или двумя видами : Obesumbacterium, Xenorhabdus, Kluyvera, Rahnella, Cedecea, Tatumella.
Классификация многих, даже хорошо изученных родов (например, Salmonella), установлена не окончательно в связи с новыми научными данными.
1.2. Факторы патогенности Генетический контроль синтеза энтеротоксинов
Патогенность представляет собой комплексный признак, основанный на биохимических механизмах, посредством которых бактерии вызывают болезнь. Это видовой признак. Штаммы бактерий одного и того же вида могут различаться по степени патогенности, что определяется термином вирулентность [Петровская, 1994].
В последнее время в составе геномов бактерий, возбудителей инфекций, обнаружены специфические области, в которых сконцентрированы генетические элементы, ответственные за патогенность. Такие "острова" патогенности (фрагменты ДНК размером до 200 т.п.н.) обнаружены только у патогенных микроорганизмов. Детерминанты "островов" патогенности способны распространяться среди одного или родственных видов бактерий путём естественной конъюгации, трансдукции или трнсформации. В результате переноса генетической информации формируются новые, в том числе и вирулентные, свойства у родственных непатогенных видов бактерий различных таксономических групп [Бондаренко, 2002].
Регуляция экспрессии факторов патогенности индуцируется в зависимости от условий внешней среды. Гены вирулентности "включаются" в организме хозяина и "выключаются" в период пребывания во внешней среде.
Помимо хромосом, несущих основную генетическую информацию, многие бактериальные клетки содержат дополнительно обособленные от хромосомы небольшие кольцевые молекулы ДНК — плазмиды, способные самостоятельно поддерживаться и реплицироваться. Хотя плазмиды и не детерминируют жизненно важные для клеток признаки и после утраты их клетки остаются жизнеспособными, от наличия некоторых плазмид в клетках бактерии проявляют признаки патогенности [Yamamoto et al., 1987].
Одним из важнейших факторов патогенности бактерий являются плазмиды энтеротоксигенности (Ent), обнаруживаемые в клетках E.coli, выделяемых от животных и людей, страдающих диареей. Smith H. и Halls S. первыми установили трансмиссивную природу генетического фактора, контролирующего синтез LT энтеротоксина, патогенного для свиней. Реципиентные штаммы, получившие плазмиду, приобретали способность
8
синтезировать энтеротоксин, о чём свидетельствовал тест дилатации лигированных участков тонкой кишки поросёнка [Smith, Halls, 1968]. Изученная плазмида передавалась независимо от факторов R, Н1у и К88. При этом было отмечено, что фактор передачи плазмиды Ent может обуславливать передачу других плазмид, в частности, нетрансмиссивных R-факторов. Поэтому плазмиды, контролирующие синтез энтеротоксина, и факторы лекарственной устойчивости бактерий способны передаваться вместе при конъюгации.
Была выявлена гетерогенность Ent-плазмид [Smith, Gyles, 1970]: конъюгативная Ent-плазмида, детерминирует синтез термолабильного (LT) или термостабилыюго (ST) токсинов, а также одновременный синтез двух токсинов (LT+ST). Кроме того, было установлено, что Ent-плазмиды, кодирующие синтез только ST, оказались гетерогенными по молекулярной массе (от 2,1x107 до 8x107Д) и по числу пар азотистых оснований гуанин-цитозин. В противоположность этому, плазмиды, контролирующие синтез одновременно разных энтеротоксинов (LT+ST), были относительно гомогенны как по молекулярной массе, так и по числу пар азотистых оснований гуанин-цитозин [Gyles et al., 1974]. Молекулярные размеры Ent-плазмид, детерминирующих синтез LT либо ST, a также одновременно синтез двух разных токсинов (LT+ST), чаще всего составляют 50-65 МД [Щипков, 2002].
Ещё одним фактором патогенности являются адгезины или факторы адгезии. Наличие в клетках энтеробактерий поверхностных антигенов (адгезинов), белковых нитевидных пилей или фимбрий, обеспечивает бактериям прикрепление к рецепторам клеток эпителия слизистых оболочек кишечника. Плазмида, кодирующая антиген К88, была открыта в клетках энтеротоксигенных E.coli, вызывающих диарею новорожденных поросят, К99 - у телят, а антигены CFA/I (colonization factor antigen) и CFA/II установлены в клетках E.coli, выделенных от людей с острой диареей и не обнаруживаются у нетоксигенных эшерихий нормальной микрофлоры человека [Мнацаканов, 1983]. Многие исследователи указывают на высокую степень корреляции между наличием у E.coli одного или нескольких адгезивных антигенов и продукцией энтеротоксинов. При этом чаще всего формирование поверхностных антигенов К99, F41, 987Р ассоциируется с продукцией ST-энтеротоксина, а К88 - с продукцией LT+ST [Mills, Tietze, 1984].
В настоящее время накапливается всё больше данных, свидетельствующих о существовании плазмид в виде комплексов, т.е. комбинаций двух и более различных плазмид в одной клетке [Мнацаканов, 1987; Пехов, 1996], вероятно обеспечивая таким образом селективные преимущества бактериальным клеткам. Составляющие плазмидного комплекса влияют на вирулентность бактерий-хозяев, что в свою очередь влияет на
тяжесть заболевания. Так, включение биплазмидного комплекса (Ent и К88) в геном авирулентного штамма E.coli, превращало его в высокопатогенный, вызывающий тяжёлую форму диареи. В то же время бактерии, имеющие одну из указанных плазмид, приводили к лёгкой форме диареи.
Исследование штаммов E.coli, выделенных от детей с острыми кишечными заболеваниями не установленной этиологии, показало, что культуры обладали двумя и более факторами патогешюсти значительно чаще (47%), чем штаммы, выделенные от практически здоровых детей (5,8%). Аналогичные исследования штаммов, выделенных от молодняка свиней и к.р.с. составили 68 и 58% соответственно.
Таким образом, патогенность - полидетерминантное свойство, обусловленное совокупным действием генетически не связанных между собой факторов.
1.3. Классификация и молекулярная организация энтеротоксинов
Патогенные Е.соИ подразделяются на две большие группы: одна вызывает развитие патологического процесса внекишечной локализации (менингиальные септицемические и урологические), другая приводит к развитию острых кишечных инфекций (ОКИ). Эшерихии, вызывающие острые кишечные инфекции разделяются на несколько типов [Levine, 1987]: энтеропатогенные (ЕРЕС) - возбудители диарей у новорожденных, энтероинвазивные (EIEC) — дизентериеподобные заболевания у детей и взрослых, энтеротоксигенные E.coli (ЕТЕС) - холероподобные заболевания, энтерогеморрагические (ЕНЕС) - геморрагические колиты и гемолитический уремический синдром [Riley et al., 1983], энтероагрегативные (ЕАЕС).
В последние годы проблема изучения энтеротоксинов приобрела особую актуальность в связи с открытием возбудителей холероподобных диарей у людей и животных - энтеротоксигенных Escherihia coli, способных к продукции энтеротоксинов, по механизму действия сходных с холерогеном.
Особенностью бактериальных токсинов является связь токсинов с другими биологически активными веществами. Токсины некоторыми участками своих молекул имитируют структуру субъединиц ферментов, гормонов, что обеспечивает микробным токсинам способность вмешиваться в различные обменные процессы у организмов, весьма отдалённых друг от друга по филогенетической лестнице [Вертиев, 1996]. Энтеротоксины E.coli вызывают одни и те же патологические реакции у птиц, животных и человека.
Диарейные заболевания, вызываемые энтеротоксигенными кишечными палочками, достаточно широко распространены. Они остаются нерешённой проблемой
10
здравоохранения и являются причиной высокой смертности [Sack, 1975]. Факторами передачи бактерий являются инфицированные продукты и вода [Guth, Pickett, 1986]. Заражение происходит перорально. Ранней неспецифической фазой инфекционного процесса является размножение бактерий в просвете пищеварительного тракта и достижения специфических рецепторов на мембранах слизистой тонкой кишки.
Последние годы отличаются бурным прогрессом в области изучения молекулярных механизмов действия энтеротоксинов и их генетического контроля. Опероны, кодирующие структуру ряда энтеротоксинов клонированы в составе векторных плазмид и определена их нуклеотидная последовательность [So, Dallas, Falkow, 1978; So, McCarthy, 1980; Spicer, Noble, 1982]. Молекулярно-биологическое исследование направлено не только на решение фундаментальных задач, но и на создание лечебно-профилактических препаратов (вакцинных штаммов, пробиотиков) и диагностических методов определения энтеротоксигенных штаммов. Используя технологии клонирования определённых фрагментов ДНК стала возможной идентификация реальных и потенциальных токсин-продуцирующих штаммов с помощью ДНК-гибридизации [Pickett et al., 1986].
Руководствуясь распространённой классификацией, энтеротоксины принято подразделять на цитотонические и цитотоксические [Keusch, Donta, 1975]. Принципиальным отличием между ними является характер их специфического действия на клеточные структуры кишечника макроорганизма.
Бактерии, продуцирующие цитотонические токсины, не способны проникать в клетки эпителия слизистой кишечника и вызывать гистологические изменения. Колонизируя тонкий кишечник без повреждения эпителия, они вызывают патологический процесс за счёт продукции токсинов, ведущий к гиперсекреции эпителия и энтеросорбции жидкости. Затем следует самоочищение поверхности эпителия от бактерий без развития воспаления.
А бактерии, продуцирующие цитотоксические токсины, способны проникать внутрь и разрушать слизистую как тонкого, так и толстого кишечника, размножаясь в эпителиальных клетках [Vaughan, Moss, 1978].
К цитотоническим относят холерный (СТ), термолабильный (LT) и термостабильный (ST) токсины, продуцируемые Vibrio cholerae, энтеротоксигенными кишечными палочками и некоторыми видами патогенных и условно-патогенными энтеробактерий.
Цитотоксические токсины представлены шигеллёзными (SLT)- и шигаподобными (цитотоксин) энтеротоксинами шигелл и энтероинвазивных кишечных палочек (EICP), а
11
также Vero-токсинами эшерихий (тоже шигаподобными). Таким образом, основными типами токсинов, продуцируемыми E.coli, являются LT, ST и шигаподобный токсины.
Наиболее часто ЭТКП, возбудители диарей у животных и человека, образуют только термостабильные энтеротоксины ST (40-50%) или комбинации LT+ ST.(30-40%), реже LT (20-30%).
Указанные токсины имеют разновидности, различающиеся по биохимическим и иммунологическим характеристикам.
Термолабильные энтеротоксины LT - высокомолекулярные белки, которые инактивируются при нагревании выше 6О°С в течение 15-45 мин, при рН 4,0-5,0 и под действием проназы. Интенсивное продуцирование LT энтеротоксигенными Escherichia coli наблюдается в течение логарифмической стадии роста и уменьшается в течение стационарной стадии роста [Minami et al., 1984]. Увеличить продукцию LT возможно подщелачиванием среды, добавлением линкомицина (50-100 мкг/мл) [Yoh et al., 1983] и аэрацией. 90 % LT сохраняется в клетках, локализуясь в периплазматическом пространстве [Hirst et al., 1984]. По структуре и функции LT очень близок к холерному токсину (СТ) [ Dallas, Falkow, 1980; Gill et al., 1981]. Оба токсина состоят из 2 субъединиц А и В [Clements, Finkelstein, 1979; Kunkel, Robertson, 1979]. Молекула LT-токсина включает в себя 1 субъединицу А и 5 субъединиц В. Субъединица А, состоящая из 2 пептидов Ai и А2 [Mekalanos et al., 1983], связанных дисульфидной связью, ответственна за токсичность, субъединица В не токсична и обеспечивает прикрепление молекулы токсина к специфическим клеточным рецепторам. А-субъединица (мол. масса 28000Д) LT представляет собой полипептид, состоящий из 254 аминокислот (18 из них являются сигнальной последовательностью), а субъединица В (м.м. 11500Д) - пептид, состоящий из 124 аминокислот (21 из них входит в состав сигнальной последовательности) [Yamamoto et al.,1982]. Прикрепление молекулы голотоксина к клеткам эпителия, осуществляется за счёт связывания субъединицы В [Holmgren, 1973; Holmgren et al., 1982; Palva et al., 1981] с рецепторами, сопрвождающееся образованием канала, через который субъединица А проникает в клетку сквозь мембрану [Gill et al., 1976]. Под действием последней увеличивается внутриклеточный уровень аденилатциклазы, снижается концентрация калия и происходит выделение хлористого натрия, что ведёт к потере клетками жидкости, развивается диарея [Moss, 1978].
Замена одной аминокислоты в В-субъединице приводит к тому, что она не может формировать голотоксин с родной А-субъединицей [Iida et al., 1989], а аналогичные действия с А-субъединицей приводят к потере токсической активности А-субъединицы термолабильного энтеротоксина Е. coli [Holmgren et al, 1982].
12
Среди LT, продуцируемых штаммами различного происхождения, имеются некоторые различия. Так например, термолабильный токсин штаммов, изолированных от людей (LTh) несколько отличается от токсина штаммов, выделенных от свиней (LTp), но эти различия касаются в основном субъединиц В [Clements et al., 1982; Guth et al., 1986], тогда как субъединицы А у LTh и LTp идентичны. Разновидности LT, продуцируемые и E.coli и V. cholerae, не различаются или почти не различаются по биологическим и иммунологическим свойствам, но обладают теми или иными физико-химическими особенностями.
Термостабильпые эитеротоксипы ST представляют собой низкомолекулярные пептиды (103-104Д), которые инактивируются после 30 минутного прогревания при 100°С, сохраняют активность при низких значениях рН и не разрушаются протеолитическими ферментами [Takeda et al., 1984]. ST-этнеротоксины ЭТКП классифицируется в две главных группы: STI и STII. Последовательность estAl, первоначально изолированная из Е. coli животного происхождения, кодирует STp, a estA2 (из Е. coli человеческого происхождения) кодирует STh. Гомология между этими аллелями составляет приблизительно 70% [Candrian et al., 1991]. Никаких биохимических и серологических маркеров для дифференцирования их не существует. Токсины проявляют различную активность на биологических моделях [ Blome'n et al., 1993], а именно: STI (или STa) активны в тесте на новорождённых мышах или морских свинках, STII (или STb) энтеротоксины не активны на указанной модели, но детектируются тестом лигированной петли кроликов, морских свинок, крыс [Gylles, 1979].
В свою очередь представителей класса STI разделяют на 2формы: STIa ( или STp -в штаммах, выделенных при диарее телят, поросят, часто сочетается с адгезином К99) и STIb (или STh -в штаммах, изолированных при диареях у людей) [Echeverria et al., 1985]. По результатам ДНК-ДНК гибридизации STIa и STIb не гомологичны, хотя состоят из 72 аминокислот, 13 из которых являются сигнальной последовательностью при трансмембранном переносе ST, т.к. отличаются друг от друга аминокислотными заменами. Определение первичной нуклеотидной последовательности генов, кодирующих STII позволило установить, что молекула STII содержит 48 аминокислот, 23 из которых являются сигнальным пептидом, и не содержит участков гомологии с STI.
STI и STII отличаются по механизму действия от LT и являются слабыми антигенами. Установлено, что STI в отличие от LT активизирует гуанилатциклазу и представляет собой пептид мол. массой 2000Д.
13 1.4. Механизм действия энтеротоксинов
Патогенез диарейных заболеваний, возбудителями которых являются энтеротоксигенные эшерихии, был изучен на лабораторных животных, а также на добровольцах и подробно описан в литературе [Moon, 1979]. В основе токсического действия бактериальных токсинов лежит нарушение регуляции важных биохимических процессов клетки.
Развитие инфекционного процесса включает 2 основные стадии: колонизацию возбудителем тонкой кишки и продукцию им токсинов. В структурной организации слизистой оболочки кишечника различают 3 слоя: слой кишечных ворсинок, выступающих в просвет кишки, слой слизистой с углублениями (криптами) и мышечный слой. Кишечные ворсинки и слой слизистой покрыты эпителием, имеющим надмембранный покров - гликокаликс, в состав которого входят гликопротеины и гликолипиды. Микроорганизмы, попав в просвет тонкой кишки, за счёт подвижности направляются к слизистой. Для прохождения сквозь неё к эпителиальным клеткам, микробами вырабатывается ряд ферментов (протеаз), разрушающих слизь. Помимо активного участия в преодолении защитной системы кишечника, протеазы бактерий путём расщепления активизируют молекулу энтеротоксина, поскольку первоначальная форма токсина в значительной мере лишена биологической активности.
Далее идёт прикрепление энтеротоксигенных эшерихии с помощью адгезинов к гликолису эпителия, потеря подвижности и размножение в этой области (колонизация тонкого кишечника). На следующем этапе синтезированный бактерией токсин секретируется и адсорбируется на клеточной мембране кишечного эпителия, связываясь с рецепторами слизистой оболочки тонкого кишечника, стимулирует активность фермента аденилатциклазы, что приводит к увеличению уровня внутриклеточного циклического аденозин-3',5'-монофосфата (цАМФ) [Holmgren et al., 1982; Урбанович и др.,1988]. За счёт этого происходит нарушение секреторного процесса, что приводит к усиленной секреции этими клетками жидкости и развитию диареи [Moss et al., 1978]. При этом у взрослых и детей старшего возраста и молодняка сельскохозяйственных животных могут наблюдаться слабые симптомы диареи, в то время как у новорождённых наблюдается профузный водянистый понос, быстро приводящий к обезвоживанию и шоку, т.к. новорожденные особо чувствительны к нарушению жидкостного баланса.
Кишечные палочки, продуцирующие энтеротоксины, через 7-10 дней после начала острой диареи исчезают из кишечника человека, однако, в некоторых случаях симптомы могут повторяться в течение нескольких недель. Энтеротоксины проявляют своё действие
14
именно в тонком кишечнике и неактивны в толстом, хотя токсигенные бактерии могут находиться в отделе толстого кишечника, вызывая острые симптомы, происходит так называемая эндогенная контаминация.
Реакция на энтеротоксин кишечной палочки может возникнуть через 15 мин. и окончиться в период, совпадающий с его вымыванием из кишечника.
Имеются работы, свидетельствующие о наличии транслокации энтеробактерий из кишечника в кровяное русло и органы с формированием эндогенного очага инфекции, особенно при терминальных состояниях. Наиболее часто проникают энтеробактерий, среди которых подавляющее большинство составляют эшерихии, а в отдельных случаях клебсиеллы, энтеробактер, серрации, протеи [Алмагамбетов и сотр.,1991].
Таким образом, патогенность энтеротоксигенных бактерий - это сложный признак, слагающийся из нескольких факторов, каждый из которых действует на определённом этапе.
1.5. Методы детекции токсигенной микрофлоры
1.5.1. Биологические методы тестирования энтеротоксинов.
Биологические методы тестирования бактериальных токсинов можно разделить на 2 группы: тестирование на животных и на культуре клеток тканей.
Тест лигировтшого сегмента тонкого кишечника кролика наиболее широко используемый тест для подтверждения наличия термолабилыюго энтеротоксина [De, 1953; Evans et al., 1973; Holmgren et al., 1982]. Впервые он был предложен Smith и Halls [1967]. В результате размножения клеток в сегментах кишки и действия энтеротоксина, происходит накопление жидкости в просвете кишки. Отношение объёма экссудата в дотированном участке к длине этого участка, превышающее единицу, оценивается как положительная реакция. Этот метод является трудоёмким, позволяет исследовать незначительное количество изолированных штаммов, обладает небольшой чувствительностью. Более того, тест с лигированным отделом кишечника маловоспроизводим : по данным Вартанян и сотр. повторяемость результатов при работе с одними и теми же штаммами составила 50%.
Дермонекротическая проба используется для оценки биологической активности LT-токсина по способности усиливать проницаемость капилляров кожи кролика, приводящая к покраснению и уплотнению кожи [Evans, Pierce, 1973] Индикатором в этом тесте является синька Эванса. Результаты учитываются по интенсивности окраски кожи и величине образующейся зоны. Метод очень лёгок в использовании, но ограничен в применении. Важным моментом этой модели является возраст: старые кролики меньше
15
реагируют на введение меньше, чем молодые [Evans, Gorbach, 1973]. Фактор капиллярной проницаемости, вызываемый LT-токсином, обнаруживается у единичных штаммов только при высоких концентрациях токсина эшерихий [Dragas et al., 1979; Ajaibet al., 1977].
t, Тест отёка конечностей белых мышей позволяет определить активность
термолабильного энтеротоксина (LT). Первоначально тест проводили на крысах [Finkelsein, 1976], позже применяли для отёка конечностей мышей. Испытуемые препараты в растворе хлорида натрия вводят в подушечку одной задней лапы, другая служит контролем [Dean, Ching, 1972; Вартанян и др., 1978]. По истечении времени максимального отёка (48ч) проводят регистрацию отёка путём взвешивания ампутированных по голеностопному суставу задних конечностей белых мышей. Величину отёка определяют разницей в массе опытной и контрольной конечностей каждой мыши. Тест превосходит по точности кожную пробу и эффективнее метода лигированной петли тонкого кишечника кролика, является простым и чувствительным.
Внутригастральный тест на мышах-сосунках позволяет определить активность термостабильного энтеротоксина (STa) , вводя его через рот 2-4-дневным мышатам-сосункам [Dean et al., 1972] При положительной реакции происходит накопление жидкости и увеличение кишечника, который извлекают спустя. 4 часа и рассчитывают
v отношение веса кишечника к весу тела мыши, сравнивая его с аналогичным в контроле.
Небольшой размер новорождённых мышей, высокая степень однородности,
* отсутствие в их кишечнике бактерий явились удобной и надёжной моделью для детекции
энтеротоксигенных штаммов и альтернативой тестированию на кроликах. Модернизированный метод [Stavric, 1977] предполагает введение 0,1 мл бесклеточного фильтрата иглой внутрибрюшинно в наполненный молоком желудок мышат. Необходимо отметить, что это единственная модель, которая не чувствительна одновременно к холерогену. К недостаткам этого метода относят неблагоприятное воздействие содержимого желудка на испытуемый препарат, неточность дозировки, значительную неспецифическую гибель мышей, клеточные лизаты испытуемых штаммов в этом тесте неактивны [Guanella, 1976]. Тест хорошо работает в отношении определения STa, но не STb.
Можно констатировать, что имеются противоречивые данные о ценности биологических тестов, т.к. они неодинаковы по чувствительности, воспроизводимости и точности получаемых результатов, весьма трудоёмки и требуют большого количества
щ лабораторных животных.
16
Методы детекции in vitro. Тесты па культуре клеток.
В поисках более совершенных систем детекции токсинов без использования лабораторных животных, воспользовались способностью термолабильного энтеротоксина E.coli вызывать биохимические изменения, действуя на определённые виды культур клеток. Так, в методе культуры мышиных адрепаловых опухолевых клеток ( Y-l) LT-токсин усиливает адренал-циклазную активность, вызывая морфологические изменения клеток надпочечников (округление), что может быть использовано для детекции токсин-продуцирующих штаммов [Donta, 1974; Sack and Sack, 1975]. Клеточная модель позволяет подтвердить in vitro образование только термолабилыюго энтеротоксина E.coli. Тест обеспечивает результаты, коррелирующие с данными теста на лигировашюй петле тонкого кишечника кролика, но более чувствителен, чем последний [Donta, 1976; Kwan, Wishnow, 1974].
Механизм действия энтеротоксинов позволяет использовать овариальпые клетки яичника китайских хомячков (СНО) и линию клеток почки африканских зелёных обезьян (vero) для обнаружения энтеротоксинов V.cholerae и E.coli [Guerrant et al., 1974; Nozawa et al., 1978; Donta, 1976]. Установлено, что обработка клеток неочищенными бесклеточными фильтратами, содержащими LT-токсин приводит к морфологическим изменениям - удлиннению клеток. При сравнении методов культуры vero-клеток, Y-1 адреналовых клеток и овариальных клеток, наилучший результат был получен при использовании У-1клеток (100%), тогда как на овариальных и vero-клетках результат не превышал 75%. Авторы указывают на малочувствителыюсть овариальных клеток к энтеротоксину E.coli и необходимость концентрации и очистки препарата токсина [Kwan, Wishnow, 1974].
Для оценки активности энтеротоксинов предлагается использовать монослойную культуру клеток кишечного эпителия эмбриона человека [De et al., 1953], в которой степень стимуляции активности аденилатциклазы пропорциональна концентрации энтеротоксина. Метод является в 200-300 раз более чувствительным, чем тест накопления экссудата в лигированной петле кролика, но определение активности аденилатциклазы основано на использовании радиоактивной метки и весьма сложен [Kantor, 1974; Kantor, 1975].
Хотя описанные методы и чувствительны, но известная специфика работы с клеточными и тканевыми культурами - специальное оборудование, квалифицированные работники, опыт интерпретации результатов — всё это затрудняет широкое применение этого способа в практических лабораториях для идентификации энтеротоксигенных |
